1）ELISA試劑盒SCI文章將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。 
2）加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。
3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。*洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。 
4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg 、HBeAg、AFP 、hCG 等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，ELISA試劑盒SCI文章就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。 
在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成 "夾心復合物"。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg 、AFP 和尿液hCG 等）時，應注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。 
假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如 HBsAg 的a 決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg 的檢測中應注意亞型問題，HBs Ag 有adr、adw、ayr 、ayw4 個亞型，雖然每種亞型均有相同的a 決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。 
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（ RF）的干擾。RF 是一種自身抗體，多為IgM 型，能和多種動物IgG 的Fc 段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有R F，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。采用F（ab’）或Fab 片段作酶結合物的試劑，由于去除了Fc 段，從而消除RF 的干擾。雙抗體夾心法ELISA 試劑是否受RF 的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標。 
ELISA試劑盒SCI文章雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。